2.3.4溫度的影響

溫度是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一。不同細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度不同。一般細(xì)菌在4℃停止生長(zhǎng)，在30℃左右生長(zhǎng)良好。已報(bào)道的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）最適溫度一般在27～37℃。由圖4可以看到，表面張力值、生物量和生物表面活性劑產(chǎn)量都隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在30℃時(shí)達(dá)到最大。乳化性在15℃到30℃時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定，在30℃到40℃時(shí)乳化性降低。實(shí)際上大多數(shù)銅綠假單胞菌的最佳培養(yǎng)溫度都在27～37℃，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖4溫度對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

表5碳氮比對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

2.3.5pH的影響

pH值也是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的因素之一。由圖5可見，細(xì)菌的生物量在pH=8的時(shí)候達(dá)到最大，且在pH8～10的時(shí)候基本平穩(wěn)；表面張力值、生物表面活性劑含量與乳化性均在pH=8的時(shí)候達(dá)到最大值，兩側(cè)均有不同程度的下降。因此該菌株傾向偏堿性的條件生存，與強(qiáng)婧等篩選的Pseudomonas aeruginosa S6最適pH一致。綜合其他報(bào)道的生物表面活性劑產(chǎn)生菌的最適pH范圍，大部分微生物都在pH6.2～8之間。

2.3.6NaCl濃度的影響

圖5 pH對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

圖6 NaCl濃度對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

NaCl濃度通過改變細(xì)胞滲透壓影響微生物的生長(zhǎng)與代謝，從而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。由圖6可見，鹽濃度在0～5 g·L-1之間，細(xì)菌生長(zhǎng)受到促進(jìn)，而當(dāng)鹽濃度大于5 g·L-1時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，糖脂量與生物量趨勢(shì)一致。菌株的生物量、生物表面活性劑量、表面張力值與乳化性均在鹽濃度為5 g·L-1時(shí)呈現(xiàn)最大，說明該菌株具有一定的耐鹽性，與強(qiáng)婧等研究的生物表面活性劑產(chǎn)生菌Pseudomonas aeruginosa S6也能夠耐鹽相似。此外，本菌株在最高為25 g·L-1的鹽濃度條件下依然能夠存活，但此時(shí)已不能產(chǎn)生更多的生物表面活性劑。

2.3.7細(xì)菌發(fā)酵動(dòng)態(tài)

在上述花生油25 mL·L-1為碳源、硫酸銨1 g·L-1為氮源、NaCl濃度為5 g·L-1、pH=8、溫度保持為30℃的最佳培養(yǎng)條件下，追蹤細(xì)菌147的發(fā)酵動(dòng)態(tài)（圖7）。菌株經(jīng)過短暫的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，108 h后進(jìn)入穩(wěn)定增長(zhǎng)期，此時(shí)菌體所產(chǎn)生的生物表面活性劑含量達(dá)到最大，此后生物表面活性劑含量減少，可能是因?yàn)楹笃谂囵B(yǎng)基內(nèi)的碳源已經(jīng)用盡，細(xì)菌開始以胞外分泌物糖脂為碳源維持生命。而表面張力值與乳化性在24 h后達(dá)到最大，之后維持在穩(wěn)定水平，說明細(xì)菌在24 h后產(chǎn)生的生物表面活性劑已到達(dá)生物表面活性劑的臨界膠束濃度，此后生物表面活性劑產(chǎn)量還會(huì)增加，但是表面張力降低值與乳化性只維持在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。

圖7銅綠假單胞菌147菌株的發(fā)酵動(dòng)態(tài)

最佳培養(yǎng)條件下，本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生物量最高能達(dá)到5.22 g·L-1（表6），生物表面活性劑量達(dá)到5.09 g·L-1。相對(duì)已報(bào)道的幾株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）合成生物表面活性劑的產(chǎn)率在2.12～15.92 g·L-1范圍內(nèi)，本菌株的產(chǎn)表面活性劑能力居中。

表6幾株銅綠假單胞菌合成生物表面活性劑的產(chǎn)率比較

2.4生物表面活性劑對(duì)多環(huán)芳烴增溶效果

圖8是水相中多環(huán)芳烴（苯并［a］芘、芘、熒蒽）的表觀溶解度隨著生物表面活性劑濃度的變化曲線，當(dāng)生物表面活性劑濃度大于300 mg·L-1時(shí)，各多環(huán)芳烴的濃度隨生物表面活性劑濃度增大而增大。這是由于生物表面活性劑在CMC（臨界膠束濃度）以上時(shí)會(huì)形成膠束，而膠束內(nèi)的疏水性微環(huán)境對(duì)疏水性有機(jī)溶劑具有較強(qiáng)的分配作用，可顯著增大溶質(zhì)的表觀溶解度［40］；當(dāng)生物表面活性劑濃度低于CMC時(shí)，生物表面活性劑分子以單體形式存在，單分子的表面活性劑對(duì)被增溶物的分配作用很弱，因而各多環(huán)芳烴在水中的溶解度變化不大或者輕微增加。

此外，由圖8可得生物表面活性劑對(duì)三種多環(huán)芳烴均具有增溶效果，且在0～300 mg·L-1增溶效果不明顯，在300～500 mg·L-1增溶明顯；四環(huán)熒蒽、四環(huán)芘、五苯環(huán)苯并［a］芘的增溶效果隨著環(huán)數(shù)的增加而降低，與楊建剛等的研究結(jié)果一致。這可能的原因是與多環(huán)芳烴的正辛醇-水分配系數(shù)（Octanol-water partioning coefficient，Kow）相關(guān)，熒蒽Kow＜芘Kow＜苯并［a］芘Kow，即Kow值越大的多環(huán)芳烴，增溶效果越低。

圖8生物表面活性劑多環(huán)芳烴的增溶作用

3結(jié)論

本研究篩選獲得了一株產(chǎn)生生物表面活性劑的147菌株，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物主要為糖脂類生物表面活性劑。以產(chǎn)生物表面活性劑量的能力為指標(biāo)，在本研究的發(fā)酵條件下，該菌株的最適碳、氮源分別為花生油與硫酸銨，最適碳氮比為25∶1，最適發(fā)酵溫度為30℃，最適鹽濃度為5 g·L-1，最適pH值為8。在上述最適培養(yǎng)條件下，該菌株的細(xì)菌生物量最高達(dá)到5.22 g·L-1，生物表面活性劑量達(dá)到5.09 g·L-1，而且該細(xì)菌能夠在偏堿性（pH值為8～13）條件下生存，具有耐鹽堿的特性。多環(huán)芳烴的溶解度隨表面活性劑的濃度增大而增大，生物表面活性劑對(duì)三環(huán)熒蒽、四環(huán)芘、五環(huán)苯并［a］芘的增溶效果隨著環(huán)數(shù)的增加而降低。實(shí)驗(yàn)表明，147菌株產(chǎn)生物表面活性劑性能突出，可進(jìn)一步研究用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。生物表面活性劑對(duì)多環(huán)芳烴污染土壤具有增溶效果，該菌株可接入多環(huán)芳烴污染的土壤增溶多環(huán)芳烴促進(jìn)土著微生物修復(fù)。該菌株具有耐鹽、耐堿等特性，應(yīng)用前景廣闊。