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堿性淀粉酶的異源表達及分子改造
來源：楊海泉 瀏覽 1663 次 發(fā)布時間:2022-10-21
堿性淀粉酶是一種在堿性環(huán)境（pH9.0~11.0）下穩(wěn)定且可以通過裂解α-1,4-糖苷鍵高效水解淀粉的水解酶。堿性淀粉酶可以應(yīng)用于紡織退漿、洗滌劑添加等領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，堿性淀粉酶在紡織退漿領(lǐng)域中應(yīng)用可以節(jié)省大量時間、降低環(huán)境污染，同時可以將對紡織織物本身造成的損壞降至最低程度。這極大提高了紡織物前處理過程中的效率，實現(xiàn)最大生產(chǎn)經(jīng)濟效益，是推動未來紡織物前處理工藝快速發(fā)展的關(guān)鍵酶制劑之一。
國內(nèi)外對堿性淀粉酶的研究主要集中在生產(chǎn)菌株篩選、酶的分離純化和酶學性質(zhì)研究方面。堿性淀粉酶在紡織退漿工藝和洗滌劑添加過程中應(yīng)用時，需要堿性淀粉酶具有強耐氧化特性和高催化效率。但野生型堿性淀粉酶的耐氧化性能差，催化效率低，需要通過分子改造提高其耐氧化性能及催化效率。
本論文實現(xiàn)了堿性淀粉酶基因（Accession No. AY268953）分別在大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)中的異源表達，并在此基礎(chǔ)上通過對堿性淀粉酶進行分子改造提高了其耐氧化特性和催化效率。
主要結(jié)果如下：
1.根據(jù)不同宿主密碼子偏好性分別優(yōu)化了堿性淀粉酶密碼子，并在宿主E. coli、B.subtilis、P. pastoris中成功表達。純化后，測定堿性淀粉酶動力學參數(shù)，分析發(fā)現(xiàn)該酶的催化效率與已報道其他堿性淀粉酶相比較偏高，適合進一步應(yīng)用研究。堿性淀粉酶的最適反應(yīng)pH值為9.5，穩(wěn)定pH范圍為8.0~11.0。酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，活化能（Ea）為36.1kJ/mol。酶在50和60℃溫度下半衰期（t1/2）分別為15.5和3.2min，酶的熔解溫度（Tm值）為64.3℃。1mM Na~+對堿性淀粉酶酶活力有激活作用，但其他金屬離子對酶活力均沒有促進作用。非離子表面活性劑對堿性淀粉酶穩(wěn)定性影響較小，但陰離子表面活性劑SDS（十二烷基硫酸鈉）可完全抑制酶的活性。液態(tài)洗滌劑和固態(tài)皂類洗滌劑對堿性淀粉酶酶活力抑制作用較強，但固態(tài)洗衣粉對酶活力影響較小。
2.通過在線模擬軟件Swiss Model對堿性淀粉酶AmyK進行同源模擬，獲得堿性淀粉酶3-D結(jié)構(gòu)。分析酶3-D結(jié)構(gòu)后，確定了活性位點周圍5個關(guān)鍵甲硫氨酸殘基（Met145、Met214、Met229、Met247、Met317）。采用單點突變方式，將關(guān)鍵氨基酸分別突變成亮氨酸后，突變體耐氧化性顯著提高，但僅突變體M247L催化效率有提高。同時，突變體M247L的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性增強。單點突變對酶表面活性劑耐受性沒有顯著影響。突變體M247L與商業(yè)洗滌劑（洗衣粉）的兼容性增強。復合突變后，突變體的耐氧化性顯著提高，特別是含有Met247位點突變方式產(chǎn)生的突變體。復合突變體M145-214L、M145-214-229L、M145-229-247L、M214-229-247L、M145-214-229-317L的底物結(jié)合能力加強。
3.基于同源模擬獲得的3-D結(jié)構(gòu)，通過單點突變方式分別將5個關(guān)鍵氨基酸突變成蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸。突變體的耐氧化性顯著增強。突變體M247T、M145I、M229T的kcat/Km值分別提高至改造前酶的1.3、1.5和2.1倍。通過對單點突變體耐氧化和催化效率變化綜合分析，確定了8種正向單點突變方式（M145A、M145I、M214A、M229A、M229T、M247T、M247L、M317I）。通過上述8種突變方式系統(tǒng)進行復合突變，共獲得8個五點突變體。其中，M145I-214A-229T-247T-317I的酶學性質(zhì)提高最為顯著：kcat/Km值提高為改造前酶的3.2倍；耐氧化性、耐堿性、熱穩(wěn)定性、表面活性劑穩(wěn)定性和固態(tài)洗滌劑兼容性均增強。
4.將6條具有不同性質(zhì)的寡肽與堿性淀粉酶N端分別融合后，在宿主E. coli BL21（DE3）中成功表達。融合寡肽1（AEAEAKAKAEAEAKAK）后，AmyK::OP1的比酶活提高為融合前酶的2.4倍。融合蛋白的Km值均減小，說明酶底物結(jié)合能力增強。AmyK::OP1的kcat值提高為融合前酶的3.4倍；同時，AmyK::OP1的kcat/Km值提高為融合前酶的5.4倍。融合后，融合蛋白的耐堿性增強。寡肽1、3、4或5與堿性淀粉酶融合表達后，酶的最適反應(yīng)溫度提高。融合蛋白AmyK::OP1的熱穩(wěn)定性和耐氧化性增強。洗衣粉對AmyK::OP1的酶活力具有激活作用；同時，其他融合蛋白與洗衣粉的兼容性也較高。融合蛋白在固態(tài)皂類和液態(tài)洗滌劑存在條件下穩(wěn)定性均較低。
5.基于對堿性淀粉酶結(jié)構(gòu)區(qū)域和氨基酸序列解析，確定了12種酶C端或N端不同截斷方式，并在截斷突變體N端融合表達寡肽1，共產(chǎn)生了24個突變體。堿性淀粉酶C端或N端截斷后，突變體AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的比酶活分別提高為截斷前酶的3.2和2.7倍。AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的kcat值均提高為截斷前酶的2倍。AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的kcat/Km值分別提高為截斷前酶的3.4和2.6倍。截斷后N端寡肽融合突變體AmyKΔC500-587::SOP和AmyKΔC492-587::SOP的kcat/Km值分別提高為截斷融合前酶的29.7和22.5倍。C端淀粉結(jié)合區(qū)域?qū)A性淀粉酶降解玉米淀粉具有重要意義，但N端序列截斷對堿性淀粉酶降解玉米淀粉能力沒有影響。寡肽1融合表達對C端截斷突變體降解玉米淀粉具有促進作用，但對N端截斷突變體降解玉米淀粉的能力基本沒有影響。隨機截斷和截斷后融合表達對堿性淀粉酶pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性幾乎沒有影響。突變體AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP的耐氧化性增強。隨機截斷和截斷后融合表達對堿性淀粉酶表面活性劑穩(wěn)定性沒有顯著影響。突變體AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP與固態(tài)洗滌劑（洗衣粉）的兼容性增強。