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Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——方法
來源：Unisense 瀏覽 2040 次 發(fā)布時間:2021-09-03
方法
設(shè)備和材料。設(shè)備。使用96孔熒光板讀數(shù)器（Sepctra Max-Gemini EM，Molecular Devices，Sunnyvale，CA）和96淺孔熒光板（Greiner Bio-one，Kremsmuenster，Austria）。
材料。用于驗證該方法的所有標準化合物均購自Fisher Scientific/AG Scientific/Aldrich/Acros/Tocris/MP Biomedicals或從Novartis存儲庫獲得，無需進一步純化即可使用。
緩沖器。pH 7.2 N-2-羥乙基哌嗪-N0-2-乙磺酸(HEPES)緩沖液、20 mM含0.1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)（MP biomedicals,Solon,OH）和pH 4.8乙酸緩沖液，使用40 mM。
熒光染料。NN-Dimethyl-6-propionyl-2-naphthylamine(Prodan)購自Fisher Scientific(Fair Lawn,NJ)。
陰離子脂質(zhì)。1,2-Dioctanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(sodium salt)(diC8PS)購自Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster,AL)。
樣品制備。測試化合物的儲備溶液。將測試化合物以10、1或0.1 mM的濃度溶解在二甲基亞砜(DMSO)中。對于在上述濃度下不能完全溶于DMSO的化合物如慶大霉素，則使用蒸餾水代替。
脂質(zhì)溶液。從Avanti購買的diC8PS氯仿中的50 mg/mL儲備溶液在氯仿/甲醇(5:1 v/v)中進一步稀釋，得到16 mg/mL的濃度，不使用時儲存在80°C。將4 mL該溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的20 mL玻璃小瓶中，并在溫和的氮氣流下蒸發(fā)溶劑。將干燥的脂質(zhì)膜分散在10 mL的20 mM HEPES緩沖液、0.1 mM EDTA、pH 7.2中，最終濃度為6 mg/mL。使用前將溶液劇烈渦旋，置于60℃水浴中孵育45分鐘。該溶液在不使用時儲存在4°C，然后在使用前用上述相同的HEPES緩沖液稀釋以獲得4和1 mg/mL溶液。染料溶液。Prodan溶解在甲醇中制成0.3 mg/mL的儲備溶液。溶液的容器用箔包裹并在室溫下避光儲存。在加入樣品溶液之前，使用甲醇將溶液稀釋至0.05 mg/mL。
圖2.在不同濃度的脂質(zhì)diC8PS下記錄的熒光發(fā)射，范圍從64μg/mL到3.47 mg/mL。在對照中，添加純DMSO代替測試化合物(O)，1.1 mg/mL的急劇上升標志著diC8PS的CMC。將10μL的10 mM硫利達嗪(9)引入基質(zhì)（20 mM HEPES緩沖液中的diC8PS），CMC轉(zhuǎn)移到較低濃度（0.042 mg/mL）。RFU：相對熒光單位。
樣品板制備和測量。通過混合10μL化合物儲備溶液（用于對照的純DMSO）、10μL Prodan溶液和正確量的脂質(zhì)溶液制備樣品板，使最終脂質(zhì)濃度為3.3、2、1、0.8、0.5、0.25、0.1、0.08、0.06、0.006和0.0006 mg/mL，每孔總體積為110μL，通過添加緩沖溶液進行調(diào)整。來自10、1和0.1 mM DMSO儲備溶液的最終藥物濃度分別為910、91和9.1μM。使用Spectra Max-Gemini EM讀板器讀取板，激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為430 nm。臨界膠束濃度的測定。將熒光讀數(shù)與脂質(zhì)濃度作圖。CMC被定義為濃度點，高于該濃度點熒光信號的增強是濃度的函數(shù)，如圖1所示。雙相線性圖的截距由諾華IT開發(fā)的內(nèi)部Microsoft Excel工作表自動確定。Microsoft Excel工作表通過從數(shù)據(jù)中的點的移動窗口中尋找最佳R2值來定位最適合垂直線性曲線的值。其余數(shù)據(jù)用于水平線性曲線。通過從垂直曲線中減去水平曲線來計算截距點，即CMC值。對照實驗中的交點代表培養(yǎng)基基質(zhì)中脂質(zhì)的CMC。
測定重現(xiàn)性。為了測試測定的再現(xiàn)性，一些化合物在不同的測定日期進行了多次測試。連同在每個測定日期運行的對照數(shù)據(jù)，變異系數(shù)(CV)的范圍為4%到8%，表明當(dāng)前方法具有良好的重現(xiàn)性（圖1）。
Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——摘要
Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——方法